روش کلاسیک استخراج DNA
ابتدا کلیات مراحل این روش را ذکر میکنیم سپس طبق پروتکل مراحل را انجام میدهیم .
مرحله اول : تهیه ی هموژن سلولی ( homogenization)
یعنی تهیه ی یک سوسپانسیون سلولی که میخواهیم DNA آنها را جداسازی کنیم که با توجه به نمونه ی مورد استفاده ، تهیه ی هموژن متفاوت است ،
مثلا در نمونه بافت : باید بافت را بکوبیم و تجزیه کنیم و سلول هایش را جدا کنیم
در نمونه خون : جداسازی سلول های هسته دار ؛ برای جداسازی نوتروفیل > استفاده از بافی کوت
برای جداسازی مونوسیت و لنفوسیت > استفاده از فای کول
همچنین محتوی DNA داخل غشاها و هسته قرار گرفته و برای لیز غشا ها استفاده از :
1: محلول هیپو تونیک ( مثل آب مقطر ) > سبب پاره شدن غشاء سلول میشود
2: دترجنت یا شوینده (مثل SDS سدیم دو دسیل سولفات ) که با پایین اوردن کشش سطحی ،غشا سلول و هسته را پاره میکند .این ترکیبات بافر لیز کننده هستند که فاز ابی دارند .
مرحله دوم : جداسازی یا حذف سایر مواد موجود در سلول ( پروتئین و لیپید و مواد دیگر)
برای این کار از فنول و کلروفرم و ایزو امیل الکل استفاده میشود که فنل و کلروفرم سبب رسوب pro میشود و ایزوآمیل الکل کف حاصل از فنل و کلروفرم را کم کرده و کمک به تفکیک بهتر فاز آبی و فاز آلی میکند. همچنین به عنوان جایگزین میتوان از آنزیم پروتئیناز k استفاده کرد که سبب تجزیه پروتئین می شود.
پس از افزودن این ترکیبات آلی به داخل میکروتیوب ، سانتریفیوژ انجام می شود ، بعد از سانتریفیوژ ، دو فاز کاملا جدا شده داخل میکروتیوب وجود دارد ،
قسمت بالایی میکروتیوب فاز آبی شامل DNA و RNA سلولی است و قسمت زیرین میکروتیوب فاز آلی وجود دارد بین این دو لایه یک خط سفید جدا کننده وجود دارد که پروتئین های دناتوره شده هستند.
مرحله سوم :تغلیظ DNA
در این مرحله باید DNA را رسوب داد که از نمک استفاده می شود این نمک پیوند های هیدروژنی بین آب و DNA را بهم می زند و باعث رسوب آن می شود و سپس از اتانول سرد 70% استفاده میکنیم.
نکته: ضربات مکانیکی شدید سبب شکسته شدن DNA میشود !
مرحله چهارم : اندازه گیری DNA
استفاده از اسپکتروفتومتری > اندازه گیری جذب نوری در طول موج 260nm
نکته 1: که اگر مقدار آن برابر یک شود یعنی 50 میکروگرم DNA داریم
نکته 2: برای ارزیابی خلوص DNA میتوان از نسبت جذب نوری در 260/280 استفاده کرد به طوری که اگر حاصل برابر یا بزرگتر از1.8 باشد > خلوص خوبی دارد، کمتر از آن نشان دهنده وجود پروتئین بیشتر در محلول است.
روش تجاری : از روش های دیگر تخلیص سازی است و راحت تر است
در اصل یک کروماتو گرافی تعویض یونی است که در آن از ستون های کروماتوگرافی برای تخلیص DNA بر اساس بار منفی آنها استفاده می کنند و درون این ستون ها ژل کروماتو گرافیanion exchanger که دارای بار مثبت بالایی هستند وجود دارد.
معمولا با استفاده از بافرهایی که کیت در اختیار میگذارد ، هموژن میسازیم و روی ستون ها میریزیم و با بافر شست و شو میدهیم تا تمام محلول ها و pro و مولکول هایی که بار منفی ندارند از ستون خارج شوند و فقط DNA متصل به ستون باقی می ماند .
در مرحله بعد با اضافه کردن محلول نمکی غلیظ > DNA را جمع اوری میکنیم .
در حین انجام این روش ها باید توجه داشت از EDTA به جای هپارین در مراحل خونگیری و extraction استفاده کرد زیرا یون هایی که باعث فعالیت انزیم های DNAase میشود را حذف میکند و مانع لیز DNA میشود.
در ادامه طبق پروتکل مراحل را انجام میدهیم:
1) 5ml خون به داخل ويال محتوي محلول EDTA نيم مولار ( 10%) ميريزيم و خوب مخلوط ميكنيم
سپس سانتريفيوژ كرده و لايه بافي كوت را جدا نموده و به يك لوله ديگر انتقال داده
٢) ٢٠٠ ميكروليتر از بافي كوت را به ميكروتيوب ١/٥ ميلي ليتري انتقال می دهیم
٣) ١ ميلي ليتر اب مقطر اضافه و ورتكس كنيد
٤) به مدت ٣ دقيقه در دور ٨٠٠٠ سانتريفيوژ كرده و سوپرناتانت را دور بريزيد
٥) مراحل ٣و ٤ را تكرار كنيد
٦)به رسوب سفيد ، ٠/٥ ميلي ليتر بافر TES اضافه و ورتكس كرده
٧) ٢٠ ميكروليتر SDS ١٠٪ به علاوه ٢٥ ميكروليتر پروتئيناز k اضافه و ورتكس كنيد
٨) محلول را ١٠ دقيقه در بن ماري ٧٠ درجه بگذاريد
٩) ٢٢٠ ميكروليتر محلول كلريد سديم ٦ مولار اضافه و ورتكس كنيد
١٠) به مدت ٥ دقيقه در ١٣٠٠٠ دورسانتريفيوژ كرده ، سوپوناتانت حاوي DNA است
١١) ٠/٥ ميلي ليتر سوپرناتانت را به لوله جديد ریخته و ٥٥٠ ميكروليتر ايزوپروپانول اضافه كرده و به ارامي مخلوط كنيد تا كلافDNA تشكيل شود
١٢) بمدت ١ دقيقه با دور ٩٠٠٠ سانتريفيوژ كرده
١٣) سوپرناتانت را دور ريخته و به رسوب ، اتانول سرد ٧٠٪ اضافه كرده و مدت ١ دقيقه در ٩٠٠٠ دور سانتريفيوژ كنيد
١٤) مايع رويي را دور ريخته و بگذاريد در حرارت محيط رسوب خشك شود
١٥) رسوب DNA را در ١٠٠ ميكروليتر محلول TE حل كنيد
16)مقدار ٥ ميكروليتر از اين محلول را به ٩٥ ميكروليتر اب مقطر اضافه كرده
١٧) OD محلول را در طول موج ٢٦٠ و ٢٨٠ قرائت كنيد
١٨) نسبت OD ٢٦٠ به ٢٨٠ نانومتر را حساب كنيد
مراحل استخراج RNA
روش‌های مختلفی برای استخراج RNA وجود دارد که از میان آنها به روش زیر که طی هفت مرحله انجام میشود اشاره می‌گردد.
۱. برداشت بافت
نخستین مرحله از استخراج RNA است که طی آن بافت مرود نظر از میان مجموعه بافتی بدن جدا میشود که برای این منظور میتوان از پروتئازها استفاده نمود. گاهی نیز در محیط آزمایشگاه بافت‌های آماده در ته فلاسک وجود دارند که برای جدا کردن آنها از تریپسین و EDTA استفاده میشود.
۲. همگن سازی
در دومین گام باید RNA و دیگر اجزای سلولی را از محاصره غشایی خارج نموده که بدین منظور باید مجموعه سلولی را تخریب کرده و ترکیبی همگن بدست آورد. RNX-Plus یا Trizol در این مرحله مورد استفاده قرار می‌گیرند.
۳. جداسازی فازها
در این مرحله RNA را از DNA و پروتئین‌های سلولی جدا می‌نمایند. پس از اضافه نمودن کلروفرم به نمونه آنرا تحت شرایط ویژه‌ای سانتریفیوژ کرده که در پایان سه فاز تفکیک شده را حاصل می‌نماید. فاز زیرین مربوط به پروتئین‌ها، فاز میانی مربوط به DNA و فاز رویین مربوط به RNA می‌باشد.
۴. رسوب سازی RNA
در این مرحله پس از انتقال فاز رویین به لوله‌ای دیگر با استفاده ایزوپروپانول و سپس سانترفیوژ RNA را رسوب میدهیم.
۵. شستشوی RNA
ششتشوی رسوب RNA با استفاده از اتانول ۷۵٪ گام پنجم را تشکیل می‌دهد. نکته: در استخراج DNA شستشو با الکل ۷۰٪ انجام میشود ولی در استخراج RNA با الکل ۷۵٪
۶. محلول سازی RNA
انحلال رسوب RNA با استفاده از DEPC treated Water ششمین گام از استخراج RNA می‌باشد
۷. تجزیه و تحلیل RNA
آخرین گام سنجش صحت استخراج RNA می‌باشد که از دو طریق اسپکتروسکوپی یا الکتروفورز کمیت یا کیفیت کار مورد ارزیابی قرار می‌گیرد.
استخراج pro
اگر پروتئین مورد نظر، توسط میکروارگانیسم‌ها به محیط اطراف آزاد نشود، در این صورت اولین مرحله خالص‌سازی، شکستن سلول‌های واجد پروتئین است. بر اساس میزان شکنندگی پروتئین‌ها و پایداری سلول میتوان از یکی از روش‌های زیر استفاده کرد:
فریز کردن و ذوب کردن پی در پی
سونیکاسیون (sonication)
هموژنیزه کردن تحت فشار بالا
هموژنیزه کردن از راه سنگ زنی (bead mill)
نفوذپذیر کردن با استفاده از مواد شوینده (مانند تریتون X-100) یا آنزیم‌ها (مانند لیزوزیم).
در نهایت با استفاده از سانتریفیوژ، بقایای سلول جدا و دور ریخته میشود و پروتئین‌ها به همراه سایر ترکیبات، به صورت محلول در مایع رویی (supernatant) باقی می‌مانند. پروتئازها نیز همراه با لیز سلولی، آزاد می‌شوند. پروتئازها می‌توانند پروتئین‌های موجود در محلول را تخریب کنند. در صورتی که پروتئین مورد نظر ما نسبت به پروتئازها حساس است، توصیه میشود که فرایند به سرعت انجام شود و عصاره سریعاً در دمای پایین قرار گیرد تا سرعت تخریب کاهش یابد. همچنین میتوان دقیقاً قبل از تخریب سلول‌ها، یک یا چند مهارکننده پروتئازی به بافر لیزکننده (lysis buffer) اضافه کرد. برخی مواقع اضافه کردن DNAse به منظور از بین بردن مقادیر بالای DNA و کاهش ویسکوزیتهٔ سلول‌های لیز شده، ضروری است.
رسوب دهی
هنگامی که میخواهیم مقادیر بالای پروتئین را خالص کنیم معمولاً اولین مرحله، رسوب دهی پروتئین با سولفات آمونیوم است. پس از رسوب دهی، سولفات آمونیوم را میتوان از طریق کیسه دیالیز حذف کرد. در رسوب دهی، گروه‌های آبگریز پروتئین‌ها در معرض قرار گرفته و با گروه‌های آبگریز پروتئین‌های دیگر تجمع پیدا می‌کنند. رسوب پروتئینی به حدی است که میتوان آن را دید. از مزایای این روشِ رسوب دهی این است که میتوان با هزینه ای کم، مقادیر بالای پروتئین را رسوب داد. پس از رسوب دهی با سولفات آمونیوم، محتوای پروتئینی با استفاده از سانتریفیوژ جدا می‌شوند.
روش‌های خالص‌سازی
انتخاب ابزار و مواد، کلید اصلی در طراحی فرایند خالص‌سازی است. در گیاهان و حیوانات، معمولاً یک پروتئین خاص به طور یکسان در سراسر جاندار پخش نشده است و برخی از اعضا یا اندام‌های جاندار، غلظت‌های بالاتری از پروتئین مورد نظر را دارا هستند. استفاده از قسمت‌هایی که واجد غلظت‌های بالاتری از پروتئین هستند، حجم مورد نیاز برای بدست آوردن مقدار مشخصی از پروتئین خالص را کاهش می‌دهد. اگر مقدار تولید پروتئین ناچیز باشد، دانشمندان از تکنیک دی ان ای نوترکیب به منظور ایجاد تغییرات در سلول و افزایش مقدار پروتئین تولیدی استفاده می‌کنند.
در خالص‌سازی آنالیتیکال به طور کلی از ۳ ویژگی برای جداسازی پروتئین‌ها استفاده میشود:
جداسازی پروتئین‌ها از طریق وارد کردن آنها در یک ژل (pH graded gel) یا ستون تعویض یونی
جداسازی پروتئین‌ها بر اساس اندازه یا وزن مولکولیشان که به این منظور از کروماتوگرافی تعویض اندازه (size exclusion chromatography) یا SDS-PAGE استفاده میشود.
جداسازی پروتئین‌ها بر اساس میزان قطبیت و آبگریزشان از طریق کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (high performance liquid chromatography) یا کروماتوگرافی فاز معکوس (reversed-phase chromatography).
معمولاً در دستورالعمل‌های خالص‌سازی یک پروتئین، یک یا چند مرحله کروماتوگرافی وجود دارد. روش ابتدایی در کروماتوگرافی این است که ستون کروماتوگرافی را با مواد مختلفی پر می‌کنند تا بستری نیمه جامد به دست آید. سپس مایعی را که حاوی پروتئین مورد نظر است از این ستون عبور می‌دهند. پروتئین‌های مختلف به صورت‌های مختلفی با ماده درون ستون برهمکنش می‌کنند و در نتیجه می‌توانند بر اساس زمانی که برای خروج از سمت دیگر ستون نیاز است، از سایر پروتئین‌ها جدا شوند. معمولاً برای تشخیص پروتئینی که از سمت دیگر ستون بیرون می‌آید، جذب آن در ۲۸۰ نانومتر توسط دستگاه استپکتروفوتومتری خوانش میشود.
ستون کروماتوگرافی را با مواد مختلفی پر می‌کنند تا بستری نیمه جامد به دست آید. سپس مایعی را که حاوی پروتئین مورد نظر است از این ستون عبور می‌دهند
روش‌های کروماتوگرافی بسیاری وجود دارد که از آن جمله میتوان کروماتوگرافی سایز اکسکلوژن (Size exclusion chromatography)، کروماتوگرافی هیدروفوبیک اینتراکشن ((Hydrophobic interaction chromatography، کروماتوگرافی تعویض یونی (Ion exchange chromatography) و کروماتوگرافی تمایلی (Affinity chromatography) را نام برد.
تغلیظ کردن پروتئین خالص شده
پس از خالص‌سازیِ پروتئین، معمولاً نیاز است تا پروتئین تغلیظ شود. روش‌های مختلفی برای این کار وجود دارد:
لیوفیلیزه کردن(Lyophilization)
اگر محلول حاوی پروتئین مورد نظر، فاقد هر گونه ترکیب دیگری باشد، میتوان آن را لیوفیلیزه (خشک) کرد. لیوفیلیزاسیون معمولاً پس از انجام کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا انجام میشود. با این کار، رسوب که حاوی پروتئین خالص است، در انتهای ظرف باقی می‌ماند.
اولترافیلتراسیون
در اولترافیلتراسیون با استفاده از غشاهایی که نفوذپذیری انتخابی دارند، پروتئین تغلیظ میشود. این غشا به آب و مولکول‌های کوچک اجازه عبور می‌دهد. در حالی که پروتئین امکان عبور از غشا را ندارد. محلول حاوی پروتئین از طریق یک پمپ مکانیکی، فشار گازی یا سانتریفیوژ، به سمت غشا هل داده میشود.
ارزیابی محصول خالص شده
متداول‌ترین روش به منظور بررسی فرایند تخلیص، انجام SDS-PAGE برای نمونه‌های مراحل مختلف تخلیص است. در این روش، تشخیص پروتئین‌هایی با وزن مولکولی مشابه نیز ممکن میشود. اگر پروتئین یک ویژگی اسپکتروسکوپی متمایز یا یک فعالیت آنزیمی خاص داشته باشد، از آن ویژگی میتوان جهت شناسایی و تعیین مقدار آن پروتئین استفاده کرد.
اگر علیه پروتئین مورد نظر، آنتی بادی وجود داشته باشد، میتوان از تکنیک وسترن بلات (western blotting) و الایزا (ELISA) برای تشخیص و تعیین مقدار پروتئین مورد نظر استفاده کرد. برخی از پروتئین‌ها عملکرد رسپتوری دارند. این پروتئین‌ها را میتوان در مراحل خالص‌سازی با استفاده از تست سنجش اتصال به لیگاند (ligand binding assay) شناسایی کرد.
.........................................................................................................................
این نوشته ممکن است دارای نواقص علمی و یا نوشتاری باشد ، لذا نویسنده , سایت با تاکید بر این نکته ، هیچ مسئولیتی در ارتباط با اعتبار این مطلب ندارد.